A técnica de eletroforese

A palavra eletroforese é originada do grego electro (eletricidade) e phóresis (transporte). A técnica foi apresentada pela primeira vez pelo químico sueco Arne Tiselius e consiste na migração de moléculas ionizadas, de acordo com suas cargas elétricas e pesos moleculares em um campo elétrico.

Os ácidos nucleicos, assim como as proteínas e outras moléculas biológicas, apresentam carga elétrica. Para o DNA e o RNA, a carga elétrica apresentada é negativa, portanto, quando moléculas de DNA ou RNA são colocadas em um campo elétrico (aplica-se uma voltagem entre as extremidades do gel que varia entre 10 e 200 V, e corrente de 50 a 300 mA), elas migram do polo negativo (cátodo) em direção ao polo positivo (ânodo). A taxa de migração da molécula dependerá de dois fatores: sua forma e sua razão carga/massa.

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Esquema de um aparelho de eletroforese. Fonte da imagem: USP.

Quando a eletroforese é realizada em um gel, em geral constituído por agarose, poliacrilamida ou uma mistura de ambos os polímeros, as moléculas de DNA de tamanhos diferentes migram através da rede de poros do gel com velocidades diferentes, em direção ao eletrodo positivo. Quanto menor a molécula, mais rápida será a sua migração no gel. A eletroforese em gel, dessa forma, separa moléculas de DNA de acordo com seus tamanhos.

A mobilidade eletroforética de um fragmento de DNA, em muitos tipos de géis, é inversamente proporcional ao número de pares de bases, até um certo limite. Géis de poliacrilamida são utilizados para separar fragmentos contendo até 1.000 pb, ao passo que géis mais porosos, feitos com agarose, são utilizados para separar misturas de fragmentos de tamanhos maiores (com até cerca de 20 kb).

Quanto maior a concentração do gel, maior a sua capacidade de distinguir fragmentos de tamanhos próximos, fator denominado DEFINIÇÃO. São utilizadas concentrações de 0,5 a 3% de agarose no gel. Por exemplo, um gel de agarose a 1% pode separar fragmentos com uma diferença de tamanho de 80 pares de bases, enquanto a 2,5% pode-se separar fragmentos com diferença de no mínimo 30 pares de bases.

Nesta imagem as bandas de DNA foram coradas com brometo de etídio, permitindo a visualização sob luz ultra-violeta. Fonte da imagem: CreationWiki.
Nesta imagem as bandas de DNA foram coradas com brometo de etídio, permitindo a visualização sob luz ultra-violeta. Fonte da imagem: CreationWiki.

Uma característica importante dos géis de poliacrilamida é o alto poder de resolução, uma vez que fragmentos de até centenas de nucleotídeos de comprimento diferindo em apenas um nucleotídeo podem ser distinguidos. A poliacrilamida polimeriza-se a partir da reação da acrilamida (C3H5NO) com a bis-acrilamida (N,N’-metileno-bis-acrilamida) em presença de persulfato de amônio e catalisada por TEMED (N,N,N’,N’- tetrametiletilenodiamino). A mistura, dissolvida no tampão de corrida desejado é posta rapidamente para polimerizar numa cuba de montagem semelhante à utilizada para agarose, mas orientada verticalmente. Também é posto um pente para a formação de poços. Normalmente, utiliza-se géis com concentrações de 4 a 25% de acrilamida. A poliacrilamida apresenta definição muito maior do que a agarose: um gel a 10% pode em certas condições separar fragmentos de DNA diferentes em tamanho por apenas um par de bases.

O modo mais fácil de analisar os resultados de um experimento de eletroforese em gel é corar o DNA, no próprio gel, com uma substância que o torne visível. Pode ser usado o brometo de etídeo (EtBr) que, quando ligado a uma molécula de DNA e é submetida à luz ultravioleta (UV), produz uma fluorescência de cor avermelhada, desde que uma quantidade suficiente de DNA esteja presente no gel. Pode-se adicionar o EtBr (10µg/mL) no gel liquefeitoantes da corrida ou levar o bloco a uma solução de EtBr com a mesma concentração e deixar descansar por alguns minutos.
No entanto, esse procedimento é bastante perigoso, pois o brometo de etídeo é um poderoso mutagênico e a radiação UV pode provocar queimaduras graves.

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Esta publicação foi escrita por dois convidados especiais: Juliana Dalbó e Carlos Cesar Jorden Almança. Ela é biomédica e cursa especialização em “Gestão em saúde pública e meio ambiente”. Ele é farmacêutico-bioquímico e doutorando em Biotecnologia pela UFES. Ambos atuam em projetos de conscientização dos riscos inerentes ao uso do álcool, tabaco e drogas ilícitas.

Juliana Dalbó

Juliana Dalbó

Biomédica, formada pela UNES - Faculdade do Espírito Santo, com especialização em Gestão em Saúde Pública e Meio Ambiente pela Universidade Cândido Mendes - UCAM. Atualmente cursa doutorado em Biotecnologia na Universidade do Espírito Santo pela RENORBIO - Rede Nordeste de Biotecnologia.
Juliana Dalbó

Juliana Dalbó

Biomédica, formada pela UNES - Faculdade do Espírito Santo, com especialização em Gestão em Saúde Pública e Meio Ambiente pela Universidade Cândido Mendes - UCAM. Atualmente cursa doutorado em Biotecnologia na Universidade do Espírito Santo pela RENORBIO - Rede Nordeste de Biotecnologia.

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