Extração de RNA de sangue humano com trizol

O RNA é muito utilizado nos laboratórios de pesquisa, mas a sua extração deve ser feita com muita atenção, pois a molécula de RNA é instável, e pode ser degradada por RNAses, presentes em vários materiais biológicos, como por exemplo a nossa pele. Então, para a obtenção de bons resultados, alguns cuidados são essenciais:

  • Limpar o local onde será realizada a extração com água sanitária e com álcool 70%;
  • Usar jaleco de manga comprida, óculos de segurança, luvas descartáveis sem talco, máscaras e touca;
  • Cabelos devem estar sempre presos;
  • Utilizar materiais descartáveis esterilizados;
  • Utilizar soluções autoclavadas, com o intuito de evitar a contaminação das amostras com RNAses;
  • Aplicar álcool 70%, RNAse away ou hipoclorito sobre a luva, durante todo o experimento.

Na maioria dos protocolos, a metodologia segue os seguintes passos principais:

  • Lise das células;
  • Purificação das amostras (remoção de contaminantes);
  • Precipitação do RNA.

Os reagentes utilizados na extração são:

  • Trizol: É uma solução monofásica de fenol e guanidina isotiocianato. Na extração, promove a lise das células e mantém a integridade do RNA;
  • Clorofórmio: Promove a separação da solução em fase aquosa e orgânica, sendo que o RNA permanece na fase aquosa;
  • Isopropanol: Precipita o RNA presente na fase aquosa;
  • Etanol 75%:Retirada de sais que possam estar aderidos ao precipitado de RNA;
  • Água DEPC (Dietilpirocarbonato): É livre de DNAse e RNAase.

Nota: O DEPC deve ser manuseado com cuidado, usando luvas, máscara e manipulado em capela sempre que possível, pois é inflamável e mutagênico.  Como o DEPC reage com aminas, não  pode ser usado para tratar soluções contendo tampão Tris, nem no tratamento de solventes orgânicos. Deve-se obrigatoriamente separar um frasco de reagente para o preparo exclusivo de soluções a serem utilizadas para a extração de RNA.

É importante que os reagentes estejam gelados no momento da extração.

Passos para a extração de RNA – Sangue periférico

1. Pipetar 250 µL de sangue homogeneizado nos tubos contendo 750 µL de Trizol LS gelado (cuidado para não pipetar nas paredes do tubo). Agitar vigorosamente (no vórtex) por 15 segundos ou até não haver mais a formação de grumos.

2. Adicione 200 µL de clorofórmio gelado nos tubos contendo a mistura de Trizol LS e Sangue. Agitar vigorosamente (no vórtex) até a solução ficar leitosa e manter a temperatura ambiente por 15 min.

3. Centrifugar por 15 min. a 12000 g, a 4ºC. Após a centrifugação será possível observar 3 fases:

  • Fase aquosa (hidrofílica): RNA;
  • Interfase: DNA;
  • Fase orgânica (hidrofóbica): Proteínas e DNA.

4. Remova a fase aquosa (transparente), 100 µL de cada vez, COM CUIDADO, aspirando reto e a transfira para um tubo de 1,5 mL, previamente identificado.

5. Descarte o tubo contendo as fases intermediária (esbranquiçada) e orgânica (rosa).

OBS.: Troque de luva!

6. Adicionar 500 µL de isopropanol gelado à fase aquosa e homogeneizar. Manter o tubo em temperatura ambiente por 10 min.

7. Centrifugar por 10 min. a 12.000 g e a 4ºC. Após a centrifugação é possível visualizar o pellet.

8. Descartar o sobrenadante, mantendo apenas o precipitado nos tubos.

9. Adicionar 1 mL de álcool 75% gelado, pipetando lentamente na parede oposta ao do pellet.

10. Centrifugar por 6 min. a 7.500 g e a 4ºC.

11. Descartar o etanol e deixar o tubo aberto para que o etanol evapore por completo (aprox. 10-15 min.).

12. Acrescentar 20 µL de tampão TE (pH = 8,0) ou água DEPC. Ressuspender o pellet com batidinhas no microtubo.

OBS.: Separar 4 µL da solução para posterior quantificação e análise da integridade.

13. Armazenar a solução de RNA a -80ºC.


Referências 

Gorjão, R.; Verlengia, R.; Costa, C. A da.; Curi, R. Extração de Ácidos Nucleicos em Amostras Biológicas: Reagentes e suas Aplicações. In: Verlengia, R. et. al. (Coord.). Análises de RNA, proteínas e metabólitos: metodologia e procedimentos técnicos. São Paulo: Santos editora, 2013. 454 p.

Corkill, G.; Rapley, R. The manipulation of Nucleic Acids: Basic tools and techniques. In: Walker, J. M; Rapley, R. (Org). Molecular biomethods handbook. 2 ed. Totowa: Humana Press, 2009. 

CARVALHO, Suzana Papile M.; Avaliação da quantidade do DNA extraído de saliva humana armazenada e sua aplicabilidade na identificação em Odontologia Legal. Revista Odonto Ciência. 2010;25(1): 48-53.

Juliana Dalbó

Juliana Dalbó

Biomédica, formada pela UNES - Faculdade do Espírito Santo, com especialização em Gestão em Saúde Pública e Meio Ambiente pela Universidade Cândido Mendes - UCAM. Atualmente cursa doutorado em Biotecnologia na Universidade do Espírito Santo pela RENORBIO - Rede Nordeste de Biotecnologia.
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Biomédica, formada pela UNES – Faculdade do Espírito Santo, com especialização em Gestão em Saúde Pública e Meio Ambiente pela Universidade Cândido Mendes – UCAM. Atualmente cursa doutorado em Biotecnologia na Universidade do Espírito Santo pela RENORBIO – Rede Nordeste de Biotecnologia.

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