Extração de DNA de leucócitos de sangue periférico por sal

A extração de DNA é um processo com várias aplicações científicas, como exemplo, na pesquisa e na medicina, seus usos incluem sequenciamento de DNA, detecção de vírus e bactérias, investigação de doenças e distúrbios de origem genética. No campo da ciência forense, é utilizada para a identificação dos mortos e dos vivos, bem como para a análise da cena do crime. Apesar de seus resultados sofisticados, a extração de DNA em si é simples.

 Antes de iniciar a extração, alguns cuidados são necessários:

  • Limpar o local onde será realizada a extração com água sanitária e com álcool 70%;
  • Usar jaleco de manga comprida, óculos de segurança, luvas descartáveis sem talco, máscaras e touca;
  • Cabelos devem estar sempre presos;
  • Utilizar materiais descartáveis esterilizados;
  • Utilizar soluções autoclavadas, com o intuito de evitar a contaminação.

Passos para a extração de DNA:

  1. Iniciar a extração com 500 µL de sangue total, coletado com tubo contendo EDTA;
  • Antes de iniciar a extração, inverter o tubo contendo sangue várias vezes a fim de obter uma solução homogênea. Caso o sangue tenha sido conservado em geladeira, deixar aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente antes de iniciar a extração.
  • Outros volumes de sangue podem ser usados, devendo-se proceder alterações proporcionais nos volumes dos demais reagentes.
  1. Adicionar 1,5 mL do Tampão de Lise de Células Sanguíneas (1X) no tubo contendo os 500 µL de sangue. Inverter 20 vezes na mão;
  2. Deixar o tubo no gelo por 30 minutos para obter a lise de células vermelhas;
  3. Centrifugar por 10 min. a 3.100 rpm a 4ºC;
  4. Adicionar 1,5 mL do Tampão de Lise de Células Sanguíneas (1X) no tubo, inverter manualmente e deixar o tubo no gelo por 30 minutos para obter a lise de células vermelhas;
  5. Centrifugar por 10 min. a 3.100 rpm a 4ºC e descartar sobrenadante cuidadosamente;
  6. Adicionar 300 µL do Tampão de Lise Nuclear (1X), e passar no vórtex por 30 seg.;
  7. Adicionar 1 µL de Proteinase K e fazer movimentos up-down cuidadosamente;
  8. Adicionar 30 µL de SDS 10% e misturar cuidadosamente as soluções até formar uma solução viscosa;
  9. Incubar 12 horas à 37ºC. Nesta etapa a solução deve ficar clara e viscosa;
  10. Adicionar 100 µL de NaCl (5M) e misturar vigorosamente por 30 seg. no vórtex;
  11. Centrifugar por 20 min. a 2.500 rpm à 4ºC;
  12. Transferir o sobrenadante (DNA!!!) para outro tubo e centrifugar novamente por 20 min. a 2.500 rpm;
  13. Transferir o sobrenadante para um novo tubo. Precipitar o DNA adicionando 2 volumes de Etanol Absoluto (temperatura ambiente). O DNA aparece como uma “nuvem”;
  14. Centrifugar por 10 min. a 10.000 rpm a 4ºC;
  15. Descartar o sobrenadante e acrescentar 1.000 µL de Etanol 70% (temperatura ambiente);
  16. Centrifugar por 5 min. a 10.000 rpm a 4ºC;
  17. Descartar o sobrenadante e deixar secar por 10 min. à temperatura ambiente;
  18. Adicionar 40 µL de água DEPC sobre o pellet de DNA e homogeneizar lentamente para desgrudar da parede do tubo;
  19. Colocar em banho-maria 30 min. a 65ºC;
  20. Armazenar a -20ºC.

Verificação da qualidade do DNA

Fazer a leitura a 260 nm e a 280 nm no NanoDrop. A relação entre as leituras em 260 nm e a 280 nm (260/280) com resultados entre 1.7 e 1.9, indicam pequena contaminação com proteínas.

Soluções para Extração de DNA

  • Tampão de Lise de Células Sanguíneas 10X

– 1550 mM Cloreto de Amônio (NH4Cl)

– 100 mM Carbonato Ácido de Potássio (KHCO3)

– 10 mM EDTA

– q.s.p 500 mL de Água Osmose Reversa Autoclavada

  • Tampão de Lise de Nuclear 10X

– 100 mM Tris-HCl (pH 8,0)

– 4 M NaCl

– 20 mM EDTA

– q.s.p 50 mL de Água Osmose Reversa Autoclavada

  • TE (Tampão Tris-EDTA)

– 10 mM Tris

– 1 mM EDTA

– q.s.p 50 mL de Água Osmose Reversa Autoclavada


Referências

LATINEN, J.; SAMARUT, J.; HOLTTA, E. A nontoxic and versatile protein salting-out method for isolation of DNA. BioTechniques, v. 17, p. 316-322, 1994.

MILLER, S.A.; DYKES, D. D.; POLESKY, H. F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research. v. 16, nº. 3, 1988.

Juliana Dalbó

Juliana Dalbó

Biomédica, formada pela UNES - Faculdade do Espírito Santo, com especialização em Gestão em Saúde Pública e Meio Ambiente pela Universidade Cândido Mendes - UCAM. Atualmente cursa doutorado em Biotecnologia na Universidade do Espírito Santo pela RENORBIO - Rede Nordeste de Biotecnologia.
Juliana Dalbó

Juliana Dalbó

Biomédica, formada pela UNES - Faculdade do Espírito Santo, com especialização em Gestão em Saúde Pública e Meio Ambiente pela Universidade Cândido Mendes - UCAM. Atualmente cursa doutorado em Biotecnologia na Universidade do Espírito Santo pela RENORBIO - Rede Nordeste de Biotecnologia.

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