Conheça a técnica RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism)

A RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) é uma técnica em que os organismos podem ser diferenciados pela análise de padrões derivados da clivagem do seu DNA. Se dois organismos diferirem na distância entre os sítios de clivagem de uma endonuclease de restrição, o comprimento dos fragmentos produzidos vai diferir quando o DNA for digerido com uma determinada enzima de restrição.

Enzimas de restrição são endonucleases capazes de clivar o DNA em locais com sequências específicas. Através de evidências fornecidas por Werner Arber, as enzimas foram purificadas e utilizadas por Daníel Nathans e Hamilton Smith em 1962. Uma das cepas da bactéria apresentava resistência a um bacteriófago (vírus) devido a uma enzima, posteriormente nomeada EcoRI, a qual clivava o DNA viral inibindo sua função metabólica. Essa enzima, então, assumia um papel de defesa na bactéria contra o parasita e, para evitar que a enzima atuasse também sobre o material genético da própria bactéria, sequências especificas do DNA eram metiladas bloqueando a ligação da enzima. Após esta descoberta já foram identificadas muitas outras enzimas de restrição.

As enzimas de restrição atuam em sítios específicos do DNA, geralmente em sequências pequenas de 4 a 6 nucleotídeos. Ao identificar a sequência, a enzima quebra a ligação fosfodiéster entre o primeiro nucleotídeo da sequência e o restante (sentido 5’ → 3’), e a mesma enzima quebra a ligação das duas fitas, pois o sítio de reconhecimento dessas enzimas normalmente é palíndromo, ou seja, o eixo de simetria e a sequência de bases é a mesma que a fita complementar, quando lida na direção oposta.

As extremidades clivadas são formadas por caudas de fitas simples (sticky ends) e são chamadas de extremidades coesivas, podendo se emparelhar novamente por complementariedade pela ação da enzima DNA Ligase. Algumas enzimas podem clivar o DNA em um mesmo ponto do sítio de restrição, não formando as caudas de fita simples, e sim extremidades abruptas (Blunt).

A técnica de RFLP é largamente usada na biologia forense em testes de DNA, visando complementar o caso. Por exemplo, sabe-se que um indivíduo possui o mesmo genoma em todas suas células, logo deverá também apresentar um mesmo número de sequências específicas para cada enzima usada. Quando o DNA de diferentes indivíduos é digerido pelas enzimas, formam-se fragmentos de diferentes tamanhos de DNA, variando conforme o número e posição das sequências. Quando estes fragmentos forem separados por eletroforese, irá ocorrer à formação de bandas diferentes no gel e únicas para cada indivíduo.

As extremidades coesivas permitem a ligação de outra fita que seja homóloga a ela, não sendo necessariamente a fita que estava anteriormente ligada. Dessa forma, pode-se inserir, por exemplo, um gene humano em um plasmídeo bacteriano e induzir nesta bactéria a produção de uma proteína desejada. Está técnica recebeu o nome de DNA recombinante e atualmente é largamente usada na produção de insulina, vacinas, hormônio do crescimento entre outras finalidades.

É usada também na identificação de polimorfismos (mutações) em genes específicos de um indivíduo ou população. Esta mutação pode acarretar na síntese de uma proteína com atividade inferior ou até mesmo inibida podendo originar doenças ou tornando a pessoa suscetível a doenças genéticas como câncer.


Referências

SAADAT, M. & ANSARI-LARI, M. Polymorphism of XRCC1 (at codon 399) and susceptibility to breast cancer, a meta-analysis of the literatures. Breast Cancer Research and Treatment, 115(1):137-44. 2008.

SPUDEIT, D.A. et al. Conceitos básicos em Eletroforese Capilar. Scientia Chromatographica. 4(4):287-297, 2012.

THOMPSON, L. H.; BACHINSKI, L. L.; STALLINGS, R. L.; DOLF. G.; WEBER, C. A.; WESTERVELD, A.; SICILIANO, M. J. Complementation of repair gene mutations on the hemizygous chromosome 9 in CHO: a third repair gene on human chromosome 19. Genomics, 5: 670- 679. 1989.

WOOD, R. D.; MITCHELL, M.; LINDAHL, T. Human DNA repair genes, 2005. Mutat Res, 577: 275-83. 2005.

ZAHA, A.; FERREIRA, H.B.; PASSAGLIA, L.M.P. Biologia Molecular Básica. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014.

Juliana Dalbó

Juliana Dalbó

Biomédica, formada pela UNES - Faculdade do Espírito Santo, com especialização em Gestão em Saúde Pública e Meio Ambiente pela Universidade Cândido Mendes - UCAM. Atualmente cursa doutorado em Biotecnologia na Universidade do Espírito Santo pela RENORBIO - Rede Nordeste de Biotecnologia.
Juliana Dalbó

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Biomédica, formada pela UNES - Faculdade do Espírito Santo, com especialização em Gestão em Saúde Pública e Meio Ambiente pela Universidade Cândido Mendes - UCAM. Atualmente cursa doutorado em Biotecnologia na Universidade do Espírito Santo pela RENORBIO - Rede Nordeste de Biotecnologia.

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