Ensaio Imunoenzimático: ELISA

O ELISA, do inglês Enzime-Linked Immunosorbent Assay, é um ensaio imunoenzimático que se baseia nas reações antígeno-anticorpo detectáveis através de reações enzimáticas. Uma das enzimas mais utilizadas neste teste é a peroxidase, que catalisa a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2) em H2O e O2.

Esse ensaio é um dos métodos imunológicos mais utilizados para quantificar a concentração de antígenos e anticorpos, apresentando grande sensibilidade e especificidade. Ele é muito utilizado para diagnóstico viral, como por exemplo, na detecção de casos de infecção pelo vírus HIV (Human Immunodeficiency virus).

Nesse método, a enzima reage com um substrato incolor produzindo um produto colorido covalentemente ligado a um anticorpo específico que reconhece um antígeno alvo. Se o antígeno estiver presente, o complexo anticorpo-enzima irá se ligar a ele e a enzima catalisará a reação. A mudança de cor, tornado-o colorido, indica a presença de antígeno.

O ELISA é um ensaio muito eficiente, pois permite detectar quantidades de proteína da ordem de nanogramas (10-9 g). No ELISA, deve-se selecionar um par de anticorpos, que podem ser monoclonais ou policlonais. O uso de anticorpos monoclonais resulta em maior especificidade, pelo fato dele ser específico para um determinado antígeno.

A ligação do antígeno ao anticorpo ocorre geralmente em microplacas contendo vários poços, onde são depositados os reagentes. Após a reação colorimétrica, a placa é lida em um leitor de microplacas.

Leitor de microplacas. Crédito: Loccus.

Há quatro métodos de se realizar esse ensaio imunoenzimático:

  • Direto: é considerado o tipo mais simples de ELISA. Nele o antígeno é fixado a uma placa de plástico, e então é adicionado um excesso de outra proteína (normalmente albumina) para bloquear todos os outros locais de ligação. Enquanto uma enzima está ligada a um anticorpo em uma reação separada, o complexo enzima-anticorpo é aplicado para fixar ao antígeno. Logo após, o excesso do complexo enzima-anticorpo é lavado e o anticorpo enzimático é deixado ligado ao antígeno. Ao se adicionar no substrato, a enzima é detectada ilustrando o sinal do antígeno.

    ELISA direto.

     

  • Indireto: é utilizado para detecção de anticorpos. O antígeno fica aderido aos poços da microplaca, e em seguida, é colocado ao soro um anticorpo marcado com uma enzima que reage com o substrato, fazendo com que o cromógeno mude de cor. A presença de cor nos poços indica a presença do anticorpo, enquanto que nos poços que não mudaram de cor, é indicada a ausência do anticorpo em questão.
    ELISA indireto.

     

  • Sanduíche ou de captura: é o método utilizado para detectar produtos secretados, como citocinas. Em vez de ligar o antígeno diretamente à placa, são ligados anticorpos específicos para o antígeno. Eles são capazes de ligar o antígeno com alta afinidade, e de concentrá-lo na superfície da placa, mesmo com antígenos que se encontram em baixas concentrações na mistura inicial. Um anticorpo distinto, marcado, que reconhece um epítopo diferente do anterior mobilizado na placa é utilizado para detectar o antígeno ligado.

ELISA sanduíche.

 

  • Competitivo: a presença e a quantidade de um antígeno em uma amostra desconhecida são determinadas pela sua habilidade de competir com um antígeno marcado pela ligação a um anticorpo fixado à placa. A curva-padrão é inicialmente construída pela adição de quantidades variáveis de uma preparação-padrão conhecida e não-marcada. O ensaio pode medir a quantidade de antígeno em amostras desconhecidas por comparação à curva-padrão. Este ensaio pode ser utilizado para medir anticorpos em uma amostra de composição desconhecida, através da fixação do antígeno apropriado ao poço e pela medição da habilidade da amostra em teste de inibir a ligação de um anticorpo específico marcado.

    ELISA competitivo.

 

Onde este teste é utilizado?

O ensaio imunoenzimático ELISA pode ser utilizado para a realização de exames de bioquímica, imunologia, hormônios e microbiologia. Para análises clínicas, esse teste pode ser utilizado para a realização de diversos tipos de exames de rotina, como por exemplo HIV, HBsAg (hepatite B), PSA, ferritina, etc.

Apesar disso, hoje em dia existem aparelhos e técnicas que podem substituir esse método, já que ele é realizado manualmente e o tempo gasto para a realização deste ensaio é muito grande. Laboratórios de pequeno porte costumam deixar acumular uma certa quantidade de amostras para poder realizar o ELISA, pois o trabalho é um só e assim fica menos oneroso.

 

Vantagens

  • Teste com alta sensibilidade, ou seja, tem habilidade de detectar quantidades mínimas do antígeno ou anticorpos pesquisados (O ELISA detecta moléculas na ordem de nanogramas), o que resulta em menor risco de falsos-negativos;
  • Teste com alta especificidade (característica que indica que o teste em questão identificará somente o antígeno ou o anticorpo desejado) – menor risco de falsos-positivos;
  • Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo;
  • Realização relativamente simples e de custo baixo a médio (em comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico).

 

Desvantagens

  • Necessidade de mão de obra especializada;
  • Alguns reagentes podem degradar-se com facilidade, com exposição à luz do sol ou a elevadas temperaturas;
  • Por ser uma técnica altamente sensível e específica, é muito susceptível a erros de pipetagem, variações nos tempos de incubação e lavagens, e alterações nos reagentes.

Referências Bibliográficas: 

  1. MURPHY, Kenneth. Imunobiologia de Janeway-8. Artmed Editora, 2014.
  2. ICB/USP.
  3. Portal Educação.
  4. Biological Solution Specialist.
Vinicius Mussi

Vinicius Mussi

Capixaba, graduado em Biomedicina, com especialização em Saúde Pública e mestre em Biociências e Biotecnologia pela UENF - Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro.
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