Técnica de Imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica é uma técnica de imunoensaio que visa identificar proteínas no tecido por meio de uma reação Antígeno-Anticorpo (Ag-Ac), a qual é revelada por um marcador visual e examinada à microscopia óptica e/ou eletrônica. A técnica permite a observação de antígenos específicos numa amostra de tecido por meio da coloração, a detecção da localização do antígeno na célula ou no tecido, além de permitir e relacionar a intensidade da coloração com a quantidade de antígeno presente no local.

Para detecção do antígeno, utiliza-se anticorpo de detecção antígeno-específico marcado com uma substância que emita coloração fluorescente, elemento radioativo, ouro coloidal ou coloração por produtos enzimáticos. Os métodos mais comuns são imuno-histoquímica por fluorescência e enzimática.

Com a utilização de coloração enzimática, as amostras são submetidas à uma reação com anticorpos específicos acoplados a uma enzima que, quando incubada com substratos enzimáticos, produz um produto que sofre precipitação direta no corte histológico gerando uma coloração que varia de acordo com o tipo de enzima e substrato.

Já no caso da utilização de fluorescência, são utilizados anticorpos acoplados a fluorocromos, que quando estimulados por luz ultravioleta, emitem um espectro de luz visível com uma coloração específica, a qual pode ser observada por microscopia de fluorescência.

Existem vários protocolos em imuno-histoquímica e eles variam de acordo com o método utilizado. O preparo da amostra a ser analisada deve seguir as etapas histotécnicas habituais de cada laboratório.

Passos da técnica

1. Coleta da amostra

Consiste em obter amostras de tecido de um determinado organismo (biópsia, cirurgia ou post mortem). Deve-se respeitar a qualidade da amostra, identificá-la e datá-la. Para preservação do tecido, deve-se optar pela fixação ou congelamento em nitrogênio líquido.

2. Fixação do tecido

Para manter os tecidos em boa qualidade para análise por microscopia é imprescindível a realização do processo de fixação, uma das etapas mais importantes da técnica.

O objetivo da fixação é impedir o metabolismo celular e a autólise tecidual, estabilizando as estruturas e os componentes bioquímicos celulares. Preservando, desta forma, a morfologia, a reatividade, além de prevenir a extração, difusão e deslocamento do antígeno durante as etapas que se seguem à fixação e não interferir com as reações subsequentes na localização do antígeno.

Os fixadores mais utilizados em laboratórios são os aldeídos, incluindo o formaldeído (10%), pelo seu baixo custo e fácil preparo. Esses fixadores formam ligações cruzadas com as proteínas do tecido, tornando-as indetectáveis pelo anticorpo. Fixadores contendo agentes oxidantes e metais pesados (como mercúrio e zinco) também são utilizados. Geralmente, uma mistura de reagentes são bons fixadores por associar as vantagens de cada fixador.

Fixadores físicos também são capazes de obter resultados satisfatórios, como fixadores a seco (carbowax 6000), fixadores no vapor e microondas (fixação por meio das ondas eletromagnéticas associada ou não a agentes fixadores químicos).

Vários fatores influenciam o processo de fixação e interferem na preservação tecidual, como temperatura, espessura tecidual, penetração, tempo de fixação, fixador, volume do fixador, armazenamento, pH, osmolaridade e concentração.

3. Processamento do tecido

O processamento tecidual permite que o tecido se torne sólido ou rígido o suficiente para suportar o corte histológico em fatias finas, para posterior observação no microscópio. Neste processamento o tecido passa pelas fases de desidratação, clarificação e impregnação.

4. Microtomia

Após a inclusão do tecido em parafina, deve-se obter fatias finas e uniformes, com espessura entre 3 a 10 µm, de forma a permitir análise dos tecidos em um microscópio. Utiliza-se o micrótomo para confecção dos cortes.

5. Recuperação Antigênica

O formol, assim como outros fixadores aldeídicos, promove ligação cruzada com proteínas teciduais, bloqueando o acesso de anticorpos aos epítopos alvo, mascarando o antígeno e diminuindo a imunorreatividade. Para que ocorra a reação entre antígeno e anticorpo, é necessário, então, desfazer as ligações realizadas durante o processo de fixação. Para tal, utiliza-se o método enzimático (tripsina ou pepsina) ou utilização do calor (panela de pressão, vapor, banho maria, microondas com imersão em tampão citrato ou trisEDTA).

6. Métodos de bloqueio de enzimas endógenas

Evita a interferência de enzimas endógenas em métodos enzimáticos, como a peroxidase endógena, fosfatase alcalina endógena, biotina endógena e proteínas inespecíficas.

7. Contra–coloração

Após a revelação da reação de acordo com o método escolhido, deve-se proceder com a contra-coloração. O objetivo é evidenciar as células para que se tornem mais visíveis e contrastadas em microscópio, a fim de evidenciar o núcleo e a membrana plasmática, onde normalmente é usada a hematoxilina. Após a coloração, adicionar a lamínula para proteção do tecido já aderido à lâmina.


Referências 

Bioinforme. Imuno-histoquímica. Disponível em: <http://www.sergiofranco.com.br/bioinforme/index.asp?cs=AnatomiaPatologica&ps=imunoHistoquimica>. Acessado em 05 dez 2014.

Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods : Pathology. DAKO A/S. Dako North America, 2009. Imunohistoquímica. Disponível em: <http://www.medicina.ufba.br/imuno/roteiros_imuno/imunohistoquim.PDF>. Acessado em 05 dez 2014.

José Ruivo. Fase pré-analítica em Anatomia Patológica, A importância do Processamento de Tecidos. Leica Microsystems. Disponível em: <http://www.sbhistotecnologia.bio.br/v2/painel/arquivos2/palestra_00000011_001.pdf>. Acessado em 05 dez 2014.

Ramos-Vara, J. A. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 2005; 42:405-426.a.

Juliana Dalbó

Juliana Dalbó

Biomédica, formada pela UNES - Faculdade do Espírito Santo, com especialização em Gestão em Saúde Pública e Meio Ambiente pela Universidade Cândido Mendes - UCAM. Atualmente cursa doutorado em Biotecnologia na Universidade do Espírito Santo pela RENORBIO - Rede Nordeste de Biotecnologia.
Juliana Dalbó

Juliana Dalbó

Biomédica, formada pela UNES - Faculdade do Espírito Santo, com especialização em Gestão em Saúde Pública e Meio Ambiente pela Universidade Cândido Mendes - UCAM. Atualmente cursa doutorado em Biotecnologia na Universidade do Espírito Santo pela RENORBIO - Rede Nordeste de Biotecnologia.

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